法医物证学（法医学分支学科）

名词解释

法医物证学

法医物证的特点

法医物证学→生物检材→遗传标记→个人识别

遗传（

）

相似

变异（variation）

有所不同

遗传标记（genetic marker，GM）

单位遗传性状

遗传性状

单位遗传性状

DNA的变性和复性

变性

复性

融链温度

Tm

串联重复序列（tandem repeats）

短串联重复序列

（short tandem repeats，STR）

可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）

假基因（pseudogene）

多基因家族

（multigene family）

转座子（transposon）

端粒（telomere）

DNA的甲基化修饰

DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）

S-腺

苷

甲硫氨酸（SAM）

基因突变

的分类

编码区碱基突变

非编码区突变

同义突变

（same sense mutation）

错义突变（missence mutation）

无义突变

（nonsense mutation）

移码突变（frameshift mutation）

终止密码突变：是DNA分子中的某一终止密码突变为编码氨基酸的密码子，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。

沉默突变（silent mutation）

DNA多态性（DNA polymorphisms）

序列不同

长度不同

DNA长度多态性（DNA length polymorphisms）

DNA序列多态性（sequence polymorphisms）

限制性片段长度多态性（restriction fragment length

，RFLP）

DNA纹印

Southern印迹杂交

限制性内切酶常见的有那些？

限制性内切酶（restriction endonuclease）

合成引物的要点，PCR的反应组成

标准的PCR反应体系

PCR反应五要素

PCR基本原理

PCR技术是模拟生物体内DNA的半保留复制，在体外合成DNA链的方法，在模板、DNA、引物、dNTP、Taq酶存在的条件下经过：“高温变性→低温退火→中温延伸”三步循环，获得大量扩增片段。

合成引物的要点：

引物合成是通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。到2018年，引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

第一步，是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

常染色体STR与性染色体STR有什么不同？

常染色体STR：

性染色体STR：

低拷贝DNA

PCR循环测序的基本原理

DNA自动测序技术

荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，不影响标记后DNA片段的电泳性质。其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异，便于检测。荧光染料的掺入的方式有两种：一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5’端。4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。这种方式被称为Dye-Primers。另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上，4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。这种方式被称为Dye-Terminators。两种方式各有特点，不过前者要求A，G，C，T分4个反应进行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。

自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序(如图所示)：

MVP（minisatellite variant repeat）序列

线粒体DNA的特点

血型（blood group）

ABO血型（重点）

一、ABO血型.4种普通血型的划分及存在相应的抗体.

1.红细胞ABO血型系统的分型。ABO血型系统分四种型：即O型、A型、B型与AB型。.

2.四种血型个体血清中存在的相应抗体：血清中有天然抗体，B型血清中有抗A抗体；A型血清中有抗B抗体；O型血清中有抗A、抗B及抗A，B等抗体；AB型血清中没有抗体ABO血型抗体恒定地存在于正常人的血清中，可以预测其存在，故称为规则抗体。.

3.正常的A、B、AB、O型的检测。利用抗A与抗B血清，以及A与B型红细胞，可以测定未知血液的ABO血型。.

二、ABO血型抗体.

正常情况下，凡红细胞没有某一种或某两种ABO抗原，又无明显的外来A或B抗原的刺激，其血清中含有与红细胞上缺失抗原相对应的天然抗A、抗A1或抗B抗体。.

(一) 抗A、抗B抗体的生成.

新生儿血中的IgG抗A与抗B抗体多来自母体，故一般不对新生儿进行血型测定。3～6个月以内的婴儿，多数尚未产生抗A与抗B抗体；6个月以后，抗体逐渐产生；5～10岁抗体效价达最高峰；随着年龄的增长，抗体效价逐渐降低，老年人抗体水平明显地低于年轻的成年人。.

(二) 抗A、抗B抗体的特性.

1、抗A与抗B抗体最显著的血清效应是凝集反应，在适当的条件下也可以发生溶血反应；.

2、ABO血型测定都在室温中(22～25℃)进行，偶尔在4℃下进行；.

3、抗A和抗B抗体可以是天然的，也可以是免疫抗体；.

4、B型与A型血液中的天然抗A与抗B抗体大多数是IgM；.

5、天然IgM与IgG抗A与抗B抗体均能在盐水介质中使红细胞发生凝集反应，在室温中具有抗体活性。.

(三)抗H抗体.

由于O、A、B或AB型红细胞结构上含有H成分，故其血清中很少有抗H抗体。.

三、ABO血型的遗传.

(一) 各种不同表型的双亲所生子女的血型。.

(二) ABO血型按孟德尔规律遗传.

ABO血型系统按孟德尔定律遗传，人类染色体上的一个座位为.A、B、O.三个等位基因之一所占，每一个体有一对染色体，一条来自父亲，另一条来自母亲，红细胞ABO型的表达由基因决定。

ABO血型有4种普通型，由复等位基因.A、B及O.所控制，有6种基因型，决定4种表现型。

四种表现型、六种基因型，一个基因座位，三个等位基因。.

何谓ABO血型的正反定型？

①正定性试验：根据RBC与特异性抗体的反应来分型，即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原。②反定型试验：依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝集原反应的性质。

试述ABO血型的DNA分型方法

①PCR-SSP序列特异性引物PCR技术：特异性强、重复性好；②PCR-RFLP。

Rh血型

HLA（human leukocyte antigen）抗原

人类白细胞膜上的抗原分为三类

HLA抗原的结构和分布

结构

HLA遗传

HLA抗原的分布

亲子鉴定（parentage testing）

非父排除概率

基础理论

1、何谓遗传标记？

个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就成为遗传标记GM。

2、何谓基因、基因型和表型？

1)基因型：是指个体一个或多个基因座上等位基因的组合，是生物体可见性状的实际基因组成。

2)表型：是指生物体某特定基因所表现的性状。表型由基因型决定。

3、Hardy-Weinberg平衡定律的前提条件和意义

1)前提条件：群体无限大、随机婚配、没有突变、没有大规模的迁移和没有选择因素的影响。

2)结论：群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变。

3)意义：

4)反映基因频率和基因型频率的关系（纯合子基因型频率=基因频率的平方，杂合子=该两基因频率乘积的二倍）

5)群体样本的检验

4、非父排除概率（P23）

PE是指孩子的非亲生父亲的男子，能够被某个遗传标记系统排除的概率。

PE用于评估某一遗传标记系统在亲权鉴定案件中的实用价值。

5、何谓个人识别概率？（P22）

个人识别概率（DP）是指在群体中随机抽取两个体，两者的遗传标记表型不相同的概率。

DP是评价该遗产标记系统识别无关个体效能大小的指标，DP越高，效能越强。

1、何谓DNA多态性？（P37）

1)在基因组DNA中，由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性。

2)按照DNA遗传标记的结构特征，DNA多态性可分为长度多态性和序列多态性。

2、何谓VNTR？（P37）

小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR。

3、何谓STR？

微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列，STR。

1、RFLP

2、Amp-FLR

3、DNA指纹图谱的基本特征？

1)遗传方式：孟德尔规律、所有片段独立遗传

2)个体的组织同一性：稳定一致

3)群体遗传学特征：

4)突变率：配子细胞形成时重排、重组与交换

4、DNA纹印图谱的基本特征？

1)高多态性

2)遗传规律：共显性

3)个体组织同一性：一致

4)群体遗传学特征：

5)高突变率：配子细胞形成时重排、重组、交换

5、何谓扩增片段长度多态性分析？

Amp-FLR：采用PCR技术扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。

6、RFLP与Amp-FLP技术有何异同？（P74）

7、STR分型用于法医物证鉴定的主要优点？

1)高灵敏度：适用于微量降解检材

2)高鉴别能力：节约检材、试剂和提高效率

3)标准化分型：实现数字化结果，利于实验室间数据交换，建立数据库

8、何谓miniSTR？miniSTR分型有何法医学应用价值？

1)miniSTR：通过重新设计引物，使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列，从而降低扩增产物的大小，进一步提高灵敏度和分型成功率，这种技术称为短片段STR分型或miniSTR分型。

2)miniSTR法医学应用价值：

STR基因座的扩增片段较短，灵敏度更高，尤其适用于微量或降解生物检材的DNA分型；

等位基因片段长度范围较窄，不易发生因小等位基因的优势扩增而造成的等位基因丢失现象；

可对多个STR基因座进行复合扩增，从而节约检材、降低成本，提高单次检测的信息量

9、何谓多基因座复合扩增？

1)在一个PCR体系中同时扩增多个靶基因座的方法叫做复合扩增。

2)复合扩增可提高单次检测的信息量，提高个人识别率，也可降低成本和检材的消耗。

10、Y-STR有何法医学应用特点？

1)Y染色体为男性特有

2)Y-STR呈父系遗传特征

3)单倍体遗传：在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，所有Y-STR基因座均呈连锁遗传，等位基因频率不能以相乘方法计算

4)GD=PE

5)结果不具有唯一性，不能认定

11、Amelogenin基因（名解）

牙釉基因（AMG）：位于X染色体Xp22，编码牙原基质牙釉质蛋白，故命名牙釉基因。在人Y染色体中心粒附近有一类牙釉基因（AMGL），与牙釉基因的碱基序列有90%同源性。用一对特异性引物可同时扩增AMG和AMGL序列片段，X特异性片段长度为977bp，Y为788bp。扩增后，男性可获得两条带，女性只观察到一条带。

但是其扩增产物较长，不适合腐败血痕、过于陈旧血痕的性别鉴定。

1、简述STR自动分型技术的主要步骤

1)DNA自动化提取

2)PCR多色荧光标记STR复合扩增

3)PCR产物电泳前处理

4)自动毛细管电泳结合激光诱导的荧光检测

5)自动数据采集并分型

2、何谓off-ladder

1)在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数字命名，在分型图谱中被标识为off-ladder

2)漂移作用和新等位基因都可标识为off-ladder

3、何谓LCN

LCN：基因组含量小于100pg的样本称为低拷贝DNA（low copy number）。

1、人类核DNA与mtDNA的比较（P179）

2、mtDNA的特点？

1)唯一的核外DNA来源

2)拷贝数多和异质性（当两种不同的mtDNA序列存在同一个细胞、组织或者个体时称之为异质性）

3)母系遗传

4)抗外切酶的环状结构有助于分子稳定性，对高度降解检材奏效

5)瓶颈效应和复制分离

6)阈值效应

3、mtDNA分型的优点？

1)高变区作为遗传标记用于法医鉴定，高变区又称D-环区

2)当细胞核DNA量不足而无法进行分型时，线粒体DNA技术分析是唯一可以利用的技术

3)生物检材中的毛发、骨干、牙齿和其他严重降解的检材也依赖线粒体DNA分析

4)简单易操作、检材灵敏度高

5)所需模板DNA减少

6)减少DNA二级结构干扰

4、mtDNA分型的主要方法？

1)mtDNA提取（抽提）

2)PCR

3)纯化PCR产物

4)循环测序反应原理ddNTP→core，only 1 primer

5、mtDNA分型的特殊问题？

1)mtDNA属于母系遗传，凡属同一母系的后代，mtDNA序列都是相同的。序列一致只能说明不排除同一个体的可能；

2)mtDNA能够提供的信息量有限（单倍型）→排除同一性（真正价值）

3)mtDNA的异质性违背同一个体mtDNA序列必然是一致的前提条件，给个体识别鉴定增加了变数；（如果多份检材异质性出现于同一位置的同一碱基贬义，反而对认定同一个体检材有利）

6、mtDNA分型的法医学应用局限性

1)分型技术要求高，耗时耗力耗钱

2)识别力相对较低：非个体唯一，共有单倍体（母系遗传）

3)异质性

4)数据库规模：易高估其识别能力

5)无法进行混合斑的检测

1、何谓ABO血型的正反定型？

1)正定性试验：根据RBC与特异性抗体的反应来分型，即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原。

2)反定型试验：依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝集原反应的性质，即用标准的A型RBC判定抗A抗体，用标准的B型RBC判定抗B抗体，同时也应用抗H抗体判定H抗原。

2、试述ABO血型的DNA分型方法

1)PCR-SSP序列特异性引物PCR技术：特异性强、重复性好 2）PCR-RFLP

3、中和试验的基本原理？

1)不完全Ab

2)遮断作用

3)判断不完全Ab是否与Ag凝集

4、Oh型血清学特点？

1)在RBC上及唾液中均无ABH抗原，即不被抗A、抗B及抗H所凝集

血清中有抗A、抗B及抗H凝集素，可分别凝集A、B、O型RBC

1、HLA抗原的分布

1)HLA-I类抗原：分布广发，几乎存在于所有的有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高。

2)成熟RBC上没有HLA-A、B、和DR抗原，幼稚RBC却有。

3)HLA-II类抗原：密度最高者为DC、单核细胞，一些吞噬细胞亚群及B细胞；

4)II类抗原作为一种分化抗原在不同细胞上表达，大多数骨髓分化细胞具有HLA-II类抗原。

2、HLA命名原则

1)以大写字母A、D、C....表示HLA遗传区域中的座位

2)HLA抗原特异性用数字表示

3)为防止与补体组分命名相混淆，HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名

4)HLA基因命名一般以4位数字表示，其中前2位数字表示对应最相近的HLA抗原特异性，后2位数字则用于表示亚型的等位基因，如A*0101

5)如果出现第五位数字，则代表“沉默取代”，即该基因虽发生了个别碱基的替换，但新密码子与原密码子属简并密码，不影响所编码的氨基酸序列

6)第6、7位数字代表相应的启动子序列的多态性

7)末尾加英文字母N表示无效基因或不表达基因

8)在不能区分等位基因时，可允许最前面的2位或4位数字表示该HLA的特异性

3、HLA遗传特征

1)共显性遗传：每个HLA基因座表达一对抗原，人类HLA每个基因座上有众多等位基因。故如果血清学方法分型时，个体只检测出了一个抗原则有三种可能：该抗原的纯合子、HLA血清板不完全、存在一种至2018年尚未发现的抗原。

2)单倍型遗传：单倍体是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基因遗传单位。

3)连锁不平衡：HLA在实际群体调查发现，各基因座的基因并非完全随机组成单倍型，有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡。处于连锁部平衡状态说明HLA不同基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。

4)HLA高多态性

4、微量淋巴细胞毒性试验原理（血清学分型）

1)微量淋巴细胞毒性试验或称补体依赖的细胞毒性试验，其分型原理为

2)Ag-Ab-C：淋巴细胞膜上的HLA抗原与已知HLA血清中相应抗体结合后，形成抗原抗体复合物，再结合补体。

3)C激活、破坏Lc：被激活的补体系统产生细胞毒性，攻击淋巴细胞，淋巴细胞膜破坏。

4)死细胞着色：经过染色，染料进入破损细胞内着色，为阳性结果。

5)计数：在倒置相差显微镜下观察，计数着色细胞所占细胞数目的百分比。

5、HLA抗血清与交叉反应

成功的关键是HLA抗血清的质量

根据与抗原决定镞的反应，可把HLA抗体分为2组：

1)抗体仅与一种HLA基因产物反应

2)抗体能与不止一种HLA基因产物结合

6、斑点杂交（PCR-SSO分型方法）

将PCR扩增片段制成斑点，用等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）杂交，通过探针放射自显影结果进行HLA分型。反向斑点杂交（RDB）：把探针预先固定在膜上，标记PCR引物。

7、比较HLA血清学分型和DNA分型方法的可靠性

HLA个体遗传差异的本质不是在于血清学方法所检测的抗原，而是在编码基因产物的DNA分子上。

DNA分型优于血清学方法在于：

1)试剂由化学合成，便于标准化和实验室间相互比较结果

2)对检材要求不高（血清学方法因需要活细胞而难以用于斑痕HLA分型）

3)血清学与DNA分型不完全相同的分型误差得以解决

血清学方法发生的错误主要集中在：

1)交叉反应抗原

2)能否正确指定属于A9和A19的亚型，这些抗原多在交叉组内或是宽特异性抗原的裂解产物

3)未能检出WHO命名的全部基因

4)纯合子细胞中存在假阳性反应

5)HLA-C大量“空白”基因，没有相应的抗血清检测它们的产物（DNA分型技术促进和改善了对HLA多态性的分辨率）

8、HLA在法医学上的意义

1)高度多态性

2)出生时已完全发育，终身不变

For 同一认定、个人识别

1、等电聚焦技术for 亚型

2、Hp分型原理、方法及法医学应用评价

Hp：结合珠蛋白，血清中，能与Hb结合使Hb过氧化物酶样活性显著↑的糖蛋白

分型：HP1-1、Hp2-1及Hp2-2

遗传变异，Hp0（无结合珠蛋白血症）:→不能用于流产胚胎或<4mon的新生儿的亲子鉴定。

原因：

1）溶血性贫血，特发性贫血，白血病，尿毒症等，患者的血浆Hp含量明显下降；

2）严重肝脏疾病如急性肝炎、肝硬化，Hp合成障碍；

3）胎儿及部分新生儿（4个月后大部分能检出）；

4）少数正常个体（注意假阴性）。

分型原理：

1)型别分离：PAG圆盘电泳：利用PAG的分子筛作用和电场作用，在柱状凝胶中分离不同型别的Hp蛋白。Hp-Hb，Hb过氧化物酶样活性使联苯胺→氧化为联苯胺蓝→显色；（just for新鲜血清中Hp型别）

2)Hp亚型等电聚焦电泳分型

3)DNA分型：利用基因特异性探针进行杂交分型、PCR扩增

3、Gc分型原理、方法及法医学应用评价

Gc：维生素D结合蛋白DPB，也成型特异性成分，电泳属a2球蛋白，主要生物学功能是结合和转运维生素D

分型原理：

1)免疫电泳

2)PAG圆盘电泳

3)等电聚焦技术

4)DNA分型

Gc法医学应用评价

1)个人识别率为0.799

2)非父排除率为34.8%

3)室温保存4个月的血痕可检出Gc型

4)4℃条件下保存6个月的尿液可检出Gc型

5)在血痕检测中，优于Hp

4、试述免疫球蛋白同种异型分型原理、方法及法医学应用评价

同种异型：是指免疫球蛋白上具有表达个体差异的抗原决定簇，由编码免疫球蛋白多肽链基因的等位基因所表达产生，表现为同一种属不同个体的免疫球蛋白抗原性不同，具有遗传多态性。

人类免疫球蛋白同种异型的命名是根据抗原决定簇位于重链或是轻链。

分型方法：

1)血凝抑制试验

2)酶联免疫试验

3)胶体金免疫层析技术

4)PCR扩增

法医学应用评价：

1)Gm及Km系统DP及PE均高于已知的RBC血型、RBC酶型及其他血清型

2)Gm及Km抗原在常温下或碱性环境中颇为稳定，溶血对抗原性无大影响

5、等位基因排斥现象：免疫球蛋白同种异型的遗传，在重链或轻链的同一位置上氨基酸不相同的同种异型是由常染色体共显性基因遗传的。但基因的表达具有等位基因排斥现象。虽然杂合子的两个等位基因同时表达，但任何一个免疫球蛋白分子只有一个同种异型。因为一个B细胞只能表达一种等位基因，称为等位基因排斥现象。

6、Gm系统：免疫球蛋白同种异型两个相互独立的连锁群基因的其中重链标记，决定IgG同种异型。

1、同工酶的分型方法

1)同工酶的多态性采用凝胶电泳方法进行分型

区带电泳：利用酶蛋白分子的大小和所携带电荷数量（酶蛋白的电荷密度的差异）→Rf

等电聚焦技术：根据酶蛋白分子的等电点不同，在pH梯度介质中，酶蛋白分子聚焦在相应的等电点pH位置上，形成狭窄而清晰的区带

2)凝胶介质上酶区带的显现及鉴定

直接底物显色法：常用于测定水解酶，无色底物被酶催化反应转变成有色产物

荧光染色法：酶催化下，非荧光底物生成高度荧光的产物或使荧光底物转化成非荧光产物（负荧光染色）

电子转移染料染色：酶催化下，同时NAD+或NADP+还原成NADH或NADPH，同时提供电子。染料还原成暗蓝紫色的不溶性甲月替。

2、PGM1分型原理、方法及法医学应用评价

PGM：磷酸葡萄糖变位酶（Mg2+→（+），Zn2+→（-））

PGM1同工酶活性很高，广泛存在于人体和动物体内各种组织中，esp心、肝。

分型：

淀粉凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳，pH7.4的缓冲系统：从（-）→（+），谱带顺序为a、b、c、d（PGM1基因产物，具有个体差异）、e、f、g（PGM2基因座产物，多态性较低）。PGM1-1=ac，PGM12-1=abcd，PGM1=ac，PGM2=bd

亚型使用PAG等电聚焦技术

DNA-RFLP分型：在PGM1的exon4和exon8中多态性碱基均涉及限制性内切酶识别序列的改变

检出时限：

室温保存的血痕样品4-6w内可以准确分型

条件较好、保存得当：3-4mon

低温保存：更长时间

陈旧血痕：可能在d带区域出现一条扩散的谱带，干扰正常判型

3、EsD分型原理、方法及法医学应用评价

EsD：酯酶D，存在于RBC和组织中的水解酶

EsD表型：3种表型，EsD1-1=12，EsD2-2=23，EsD2-1=123（其中1带活性最高）

分型方法：

淀粉凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳法：分辨率较好、方法简便、较常用

醋酸纤维素膜电泳法

PAG等电聚焦法

检出时限：室温3-4mon，低温0.5yr；组织检材EsD分型的检出时限较血痕短。

4、EAP分型原理、方法及法医学应用评价

1）EAP：红细胞酸性磷酸酶，酶活性以前列腺最好，RBC次之。

2）分型：

淀粉凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳

醋酸纤维素膜电泳

PAG等电聚焦电泳

3)检出时限：室温9w

4)早孕绒毛组织EAP表型能代表胎儿表型，可用于妊娠早期的亲自鉴定

5、作为个人识别和亲自鉴定的同工酶的条件：

1)酶型多态性程度高，鉴别能力及PE高

2)酶的催化活性易于测定

3)酶活性高而稳定，不易受干燥和其他理化因素影响

4)电泳检测操作简便，结果重复性好

5)除血液外，在其他人体组织及细胞也可检出相同的型别

1、何谓PE

PE：非父排除概率，是指不是小孩生父的男子（简称非父）能被遗传标记排除的概率。

是衡量遗传标记系统在亲子鉴定中实用价值大小的指标。不同遗传标记有不同PE值。

2、试述父权指数与父权相对机会

1)父权指数：是亲子关系鉴定中判断遗传证据强度的指标，它是判断亲子关系所需要的两个条件概率的似然比，即具有AF遗传表型的男子是孩子生物学父的概率（X）与随机男子是孩子生物学父亲的概率（Y）的比值，PI=X/Y。

2)父权相对机会：是两个条件概率的比值，它的一个条件概率可以按Bayes定理换算成为另外一个条件概率，从而引出另一个参数，称之为父权相对机会（RCP）或父权概率（W=PI/（PI+1）），

3、何谓排除父权的标准

1)否定父权不仅需要考虑遗传标记在两代人之间是否符合遗传规律

2)也要考虑遗传标记在亲子鉴定中的系统效能（DP）

遗传标记数↑，CPE↑，鉴定能力↑；由于是的遗传标记↑，遇到遗传变异的可能性↑；

P285为了避免潜在遗传变异的影响，排除父权至少应根据两个以上遗传标记。

4、何谓认定父权的标准

1)父权指数：

2)父权相对机会：

3)实验用遗传标记累计排除概率大于等于0.9999.

4)CPI>10^4

定义及其范围

1.生物物证，物证是指对案件的真实情况有证明作用的物品。物证包括的内容很多。其中生物体(人或动物)的组织器官、各种体液、分泌液、排泄物及其斑痕等生物性检材是本学科研究对象。

2.生物检材的范围。

(1) 体液及其斑痕。

(2) 各种人体组织、器官。

任务

一、任务：解决生物性检材的个人识别及亲子鉴定等问题。

二、意义：法医物证的鉴定可以为侦查破案提供线索，缩小侦查范围，可揭露犯罪事实真相为案件的审判提供科学依据。

三、民事案件或刑事案件需作法医物证所涉及的情况。

研究方法

法医物证是一门应用科学，研究的方法涉及多种学科包括：

一、化学

二、物理学

三、电子计算机

四、形态学

五、免疫血清学

六、生物化学

七、分子生物学

八、遗传学等方法

提取、保存

（一）基本规则

1．检材均应直接提取，易携带物品整体提取；不易携带物品提取附着检材的部位。2．根据检材附着的不同载体，应采取擦拭、剪切、刮削、吸附、浸泡、凿锯、挖取等方法提取。

3．在提取检材前后应进行照相或录像。

4．不同部位的检材应分别提取，单独包装。

5．提取用具要洁净。

6．使用适当的封装材料，做好检材提取记录。

7．提取检材时，注意要提取对照样品。

8．提取的各种新鲜液体物证应尽快检验，剩余部分应制成纱布斑迹干燥保存；人体组织应冷冻保存。

9．提取的各种体液性的检材应在阴凉通风、可防止污染处自然干燥成纱布斑迹，禁止暴晒或加热烘干。

10．提取的检材在包装和携带运送过程中应避免互相摩擦、冲撞以及失落，易碎检材防止挤压和震动，易散失检材严密包装，易腐败检材低温保存送检。

（二）防止污染原则

1．提取检材时必须使用一次性用具，每提取完一份检材应及时更换，禁止重复使用和赤手触摸检材。

2．提取检材时必须使用无菌的提取试剂和转移用载体。

3．提取检材时不得说话、打喷嚏等，以免造成污染。

4．提取检材时一次只能提取一件检材。

5．禁止多件检材混合包装，禁止重复使用封装材料。

（三）个人防护原则

1．所有的检材应都视同为可能的传染源，提取检材时应穿戴好防护用品。

2．检材提取人员手上的任何切口和擦伤都要用防水织物包扎。

3．在提取开始和结束后对手部进行消毒。

1．法医物证检材包括血液（痕）、精液（斑）、唾液（斑）、毛发、组织、骨骼等各种含有人体细胞的生物检材。由于载体的不同，现场提取时需注意去发现和提取各种形式的生物物证检材。

2．提取检材前注意记录检材的大小、形态等特征提取的检材必须分别包装，在包装袋上注明检材名称、来源、数量、采集日期等，并有采集人及采集见证人的签名。

3．对于活体检材，一般用医用消毒纱布或中速滤纸采集指血或耳垂血（2cm2以上），自然晾干。可以用口腔拭子提取口腔粘膜细胞，提取前须清水漱口，检材自然晾干；或取毛发3根－5根。以上检材均用纸袋包装后常温保存。

4．对于血痕，类似衣裤、地毯、床单上的血痕，可以剪下一部分纸袋包装后常温保存；类似衣柜、墙壁、地面、刀、斧上的血迹可以刮取，或用生理盐水浸湿的纱线提取，自然晾干后纸袋包装常温保存。

5．涉嫌性侵害的，应用棉签分别提取阴道外端、中部和后穹窿部，必要时还应注意会阴、下腹、口腔、肛门等部位有无精液（斑），以及现场怀疑有精斑的其他检材，如床单、被褥、卫生纸、避孕套、内裤、衣物等。所有检材应该分别提取、标明记号、自然晾干、纸袋包装后常温保存。

6．现场的可疑毛发用镊子提取，用纸折叠后置纸袋内常温保存。

7．含有唾液斑的检材如烟头、果核、香口胶等用镊子提取，纸袋包装后常温保存。8．人流刮宫组织，取5g以上确认为绒毛的组织；引产胎儿，取5g以上的组织；羊水，取2ml以上的液体。提取的检材洁净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。

9．新鲜尸体，可用医用消毒纱布或中速滤纸提取血液（3cm2以上），自然晾干，纸袋包装后常温保存。新鲜尸体也可取肌肉组织（50g以上）；腐败尸体，尽量提取相对新鲜的组织，包括指甲（2枚以上）、肋软骨（5cm以上）或者其它软骨（5g以上）、深部肌肉组织（5g以上）、毛发（10根以上）；白骨化的尸体尽可能提取指甲、长骨、牙齿、毛发。以上检材洁净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。

10．根据案件情况，注意提取对照样本。

检材提取要领

不损失、不污染、不破坏

1)翻动物件或是提取物证前，要先拍照、录像、绘图、记录和测量，以显示物证原始状态和位置

2)必须戴手套持洁净器具提取，禁止用手直接触摸检材

3)提取的检材宁多勿少，尽量保持其原状不受损伤

4)根据检材的种类采用适当的方法提取

5)不同部位的检材应分别提取、分别包装，并贴有唯一独特标记

6)根据案件的情况，应尽量采集相关的对照样本

7)提取的检材必须详细登记

8)严格遵守有关法律法规的规定

物证检验

1、联苯胺实验

1)血痕预试验，灵敏度高，操作简便快速，特异性不好

2)意义在于阴性结果可以否定血痕

3)原理：利用血痕中的Hb或正铁血红素具有的过氧化物酶活性，使过氧化氢释放出新生态氧，将无色联苯胺氧化为联苯胺蓝。

4)取材注意：刮取微量，节约检材

2、血色原结晶实验（高山结晶试验）

1)确证试验，特异性好，灵敏度不高

2)意义在于阳性结果可确证检材为血痕

3)原理：Hb在碱性溶液中分解为正铁血红素和变性珠蛋白。在还原剂作用下，正铁血红素还原为血红素，同变性珠蛋白和其他含氮化合物（如吡啶、氨基酸等）结合形成血色原结晶。

3、吸收-解离实验

1)血痕的血型测定

2)要求Ab效价高一点好

3)原理：

可逆的结合反应——血痕中的A、B、H抗原能与相应的抗-A、抗-B、抗-H抗体发生特异性的结合反应；

加热解离——56℃加热后，血痕上抗原结合的抗体可以解离下来；

指示RBC检测解离液中Ab——用已知A、B和O指示红细胞检测解离液中抗体。

结果判定——凝集（+），不凝集（-）

4、血痕检验一般遵循的基本程序是什么？

1)肉眼检查

2)预试验

3)确证试验

4)种属鉴定

5)遗传标记测定

6)其他试验等：出血部位（混有组织细胞）、出血量（重量、分光光度）、出血时间

1、如何进行精液斑的个体识别

1)ABO血型测定：中和试验（分泌型）、酶标抗体免疫测定法（非分泌型）、DNA分型（PCR、PCR-RFLP）

2)DNA分析：DNA提取（需要加入DTT）

2、试述精液斑与血痕ABO血型分型方法的区别

1)精液斑：

中和试验（分泌型）

酶标抗体免疫测定法（非分泌型）

2)血痕：

吸收试验（吸收-抑制试验）

解离试验（吸收-解离试验）

3、试述精液斑与血痕DNA提取方法的异同

1)异：

精液斑：必须要切断二硫键以消化蛋白（膜）→DTT（二硫苏糖醇）

血痕：有机溶剂or Chelex-100

2)同：PK、SDS

4、试述Y-STR分型技术在精液斑个人识别中的优缺点

1)Y-STR呈男性伴性遗传，不与其他染色体重组，除突变外，在父系的所有男性个体都具有相同的Y-STR单倍型，因此可利用父系亲属的参考样本进行犯罪嫌疑人的排除推测；

2)只具有排除同一性意义，不能认定同一性。

5、精液斑检验的一般程序——

1)肉眼观察：UV（银白色）；白、痂、鳞、硬、腥；

2)预实验：酸性磷酸酶试验AP（红色醌类化合物）//预实验阴性的检材仍要进行确证试验；

3)确证实验：精子检出法（染色）

4)种属鉴定：抗人精液血清沉淀反应

个体识别：ABO血型（中和试验、酶标抗体免疫测定法、DNA分型）、DNA分析

1、如何进行唾液斑的个体识别（just like 精液）

1)ABO血型测定：中和试验（分泌型）、酶标抗体免疫测定法（非分泌型）、ABO基因分型//脑脊液无ABH抗原

2)DNA分析：口腔黏膜脱落上皮细胞（nDNA and mtDNA）→PCR-STR

1、差异提取法及其优缺点

2、轮奸案混合斑检验

1)注意提取多处检材或一份检材不同部位的斑痕→分别进行DNA提取和扩增分型→有single？

2)几个犯罪嫌疑人精液的含量差别很大时，造成精液成分特异性片段的密度或峰高值的个体差异→有时能够为确定精液的个体发挥作用

3)Y-STR分型→确定人数、排除嫌疑人等

3、试述进行精液与阴道液混合斑个体识别的几种思路

目的：检测出精液成分遗传标记（确定犯罪嫌疑人）+认定受害者

1)Y/N 混合斑（确证试验）：

精斑确证——精子检出

阴道液斑确证——细胞学检查（HE染色、嗜碘试验）、阴道肽酶测定Vp（不受月经血和精液影响）

2)个人识别：（从混合斑测出的遗传标记型别是精液与阴道液遗传标记的总和）

a)对比推断法：

ABO血型测定：中和试验forABH物质分泌状态

DNA分型：混合分型图谱，locus（sgl） alle≥3，直接与受害人对比

b)分离精液和阴道液组分进行检测：差异提取法、激光捕获显微切割技术

c)检测精液特有成分：Y染色体DNA分析、阴道分泌液的血清型或酶型

4、试述如何对混合斑STR分型结果进行分析和解释

（分型结果为多个个体的STR图谱累加）

1)确定是否为混合斑——多个>2个峰的图谱//nor H1 > 60% H2，stutter < 15%mainH

2)确定等位基因峰——according to ladder

3)确定构成混合物的组分数——n个等位基因数提示至少有n/2（Z）个组分

4)统计分析：似然率法

5)结巴带

6)等位基因丢失

7)LCN影响

8)Amelogenin基因的X和Y峰面积——判断是否为混合斑＆混合斑中男女成分比例

Y-STR基因座等位基因数——推断混合斑的最少组分数目

1、提取和送检组织材料时应注意的问题有哪些？（P357）

1)尽快送检

2)组织检材不能及时送检时应低温保存，或干燥处理，所有组织样本不宜用甲醛固定

3)不同组织中含蛋白酶量不同，自溶和腐败的速率有明显差异→肝脾usu不作为首选取材，muscle和cerebral tissue等提取DNA较理想

证据意义评估

1、怎么评估遗传标记个人识别的系统效能（i dont know . just note 2 points we should be aware of ,i think）

遗传标记的多态性程度越高，DP越高

提高DP可以通过增加检测的遗传标记数目来实现

2、怎么评估遗产标记对于具体个案的鉴别能力

1)匹配概率

2)似然率

3、试述匹配概率的意义

概念：一个随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配的可能性

用途：遗传标记的个案应用

数值意义：Pr↓，→0，说明随机个体碰巧匹配的可能性小，作为证据的检材与嫌疑人的表型匹配非常不像是一个随机事件，因此支持这两个样本来自同一个人的假设，也就是支持现场检材是嫌疑人留下的假设。