酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验）

吸附试验

自从Engvall和Perlman(1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。

如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

酶联免疫吸附试验

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。

用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。

过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。

酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变，是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。

系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μgHRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。

测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。

⑴酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。

⑵结合物的定量测定一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：

酶量（mg/ml）=OD403×0.42

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62

对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62

已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。

HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4

结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量

结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%

用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时最好。

ELISA方法的基本类型、用途及操作程序

根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下。

⑴材料

①包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；

②DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；

③ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

⑵方法步骤

①加抗原包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干

②加待检血清→37℃2小时，洗涤三次、抛干

③加酶标抗体→37℃2小时，洗涤三次、抛干

④加底物液→37℃30分钟，加终止液

⑤用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

⑶结果判定已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。

①加抗体包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干

②加待检抗原→37℃30分钟，洗涤三次、抛干

③加酶标抗体→37℃30分钟，洗涤三次、抛干

④加底物液→37℃15分钟，加终止液

⑤用ELISA检测仪测定OD值。

此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：

①加抗体（Ab-1）包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干

②加待检抗原（Ag）→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

③加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2)→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

④加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

⑤加底物液→37℃20分钟，加终止液

⑥用ELISA检测仪测定OD值。

此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：

①抗体包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干

②加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

③加底物液→37℃20分钟，加终止液

④用ELISA检测仪测定OD值。

被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。

本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：

①100μlAP2型工作量抗原包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干

②用200μl阻断缓冲液进行封闭→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

③加工作量1:4稀释被检猪血清100μl→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

④加100μl工作量兔抗AP2型血清→37℃30分钟，洗涤三次、抛干

⑤加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

⑥加100μlOPD底物液→37℃20分钟，加终止液

⑦用ELISA检测仪测定OD值。

本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：

①用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干

②加待检血清→37℃2小时，洗涤三次、抛干

③加酶标抗原→37℃60分钟，洗涤三次、抛干

④加底物液→37℃20分钟，加终止液

⑤用ELISA检测仪测定OD值。

与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：

⑴载体膜的预处理及抗原包被取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。

⑵封闭将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。

⑶加被检血清可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。

⑷加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。

⑸显色加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。

⑹结果判定以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。

（C－ELISA）C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B.W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（HydrophobicPolyesterCloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：

⑴首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；

⑵加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；

⑶加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；

⑷加入底物液显色；

⑸测定OD值。

影响因素

酶联免疫(ELISA)是如今检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。但是，如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响实验的因素，减少差错事故的发生是极其必要的。

实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。首先应具备一个良好的思想素质，因为我们的服务对象是人，我们的道德水平直接关系到人们的健康和生命安危，如果马马虎虎。三心二意，难免会有差错事故发生，我们应该热爱专业，耐心细致。在工作中如标本混淆、张冠李戴、报告单发错等都有可能造成严重后果；其次文化素质和技术素质，我们要熟练掌握本专业的基本理论和基本技术，认真学习新理论新知识，努力提高自己的业务水平，创造一个能够胜任本职工作的技术平台。良好的心理素质就是要勇于面对工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有条不紊，冷静沉着的处理有关事务。人员素质问题是影响检验结果的首要因素。

实验室人员收到标本后应认真查对，对不符合要求的标本和申请单要拘收，合格标本要及时分离血清，避免溶血，提取血清时不应混有大量纤维蛋白或细胞成分。对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录，标本管上最好标上待检者姓名、日期。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，并充分混匀再用。

注意事项

1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18C～25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。

2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。

3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。

4、要保证加液量一致我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。

5、显色液量不可过多加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。

6、试剂的影响因数：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。