RT -PCR（用于检测基因表达水平的反应）

简介

RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

反转录酶选择

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。

2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

合成引物选择

1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

试剂准备

1．RNA提取试剂

2．第一链cDNA合成试剂盒

3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

4．Taq DNA聚合酶

影响因素

（一）组织或细胞样本

不是每种组织或细胞都表达所有的基因，即某些基因的mRNA不存在于某些组织或细胞中。因此，确定所选用的材料中是否含有需扩增的目标mRNA模板是实验成败的关键。

（二）引物

合成cDNA第一条链时，引物可用随机6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的随机引物效果最好。

（三）反转录酶

不同来源的反转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成，其合成受不同RNA模板的影响。提高反转录温度（55℃）、增加1～3倍的酶量可克服RNA二级结构的影响。

（四）cDNA反应产物

合成eDNA第一链所用的RNA模板不影响PCR反应，无需用碱或RNase处理去除。另外，没有必要将cDNA反应产物全部用于PCR，用其1/25～1/10即可。

（五）RNA酶污染

避免RNA酶污染是RT—PCR成功的关键之一。用于RNA操作的各种器皿，包括Eppen—dorf管、Tip头等，都应该用RNA酶抑制剂处理，试剂应该用RNase—free水配制。使用的全部器皿和耐高压的试剂都必须经高压灭菌处理。在操作全过程中，操作者都应该戴一次性手套和口罩，以防污染

操作步骤

RT-PCR反应原理

2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例：

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列试剂的混合物：

10×PCR buffer 2μl

25mM MgCl2 2μl

10mM dNTPmix 1μl

0.1M DTT 2μl

轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加热15min以终止反应。

（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：

第一链cDNA 2μl

上游引物（10pM） 2μl

下游引物（10pM） 2μl

dNTP(2mM) 4μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

注意事项

1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5． 防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

三点注意事项合成cDNA的引物，避免RNA酶的污染，不同来源的逆转录酶。