质谱成像（质谱成像）

简介

最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）质谱分子成像技术，由范德堡大学（VanderbiltUniversity）的Richard Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。

原理

MSI技术的工作原理：首先以适当的方式获取和制备待测样本，质谱仪按照预先设定的采集程序，利用激光或高能离子束等扫描样本，使其表面的分子或离子解吸离子化，再经质量分析器获得样本表面各像素点离子的质荷比和离子强度，借助质谱成像软件在各像素点的质谱数据中搜寻任意指定质荷比离子的质谱峰，结合其对应离子的信号强度和其在样本表面的位置，绘制出对应分子或离子在样本表面的二维分布图；继而采用上述软件对样本连续切片的二维分布图进行进一步数据处理，获得待测物在样本中的三维空间分布。

获取与制备

样本制备过程是影响质谱成像结果真实性和准确性的关键环节，其处理方法和技术与待测物自身的性质、所处的样本类型和状态密切相关。通常，MSI技术用于药学研究多以动物、组织、细胞和固体制剂作为分析对象。

恰当而迅速的样本收集与固定是维持样本中分子或离子的真实空间分布和丰度的保证。一般常用颈椎脱臼、断头、麻醉放血、吸入CO2等方法处死动物以获得整体样本，应注意不同处死方法对特定器官中待测物可能产生的影响。器官等组织样本可由活体组织检查或动物解剖获得。细胞样本可以从培养基中分离。

为避免待测物的移位和降解，样本一经收集应迅速固定。器官等组织样本和整体动物样本最常用的固定方法是快速冷冻。组织样本通常冷冻于液氮或干冰预冷的异戊烷中；整体动物样本则多置于干冰，正己烷浴中。经过快速冷冻的样本，在 -70℃以下储存时间1年内可以保持相对稳定，获得的MSI结果可靠。采用福尔马林固定石蜡包埋保存活检样本时，可通过对样本表面喷涂反应性基质或进行原位酶解来消除福尔马林引起的蛋白质共价交联。快速可控的热处理多用于防止室温下酶因活性恢复而降解待测物，但因热处理可能细微地改变样本的形态结构，因此只适用于脑、肾、移植瘤等细胞排列紧密的组织。采用冷冻固定法可以很好地维持细胞的形态和细胞内可扩散离子的空间分布。为固定细胞，需先采用维持细胞渗透压和酸碱平衡的甲酸铵溶液洗去细胞表面的盐类，然后快速冷冻并进一步冷冻干燥，以除去甲酸铵和水。当使用化学固定法(如戊二醛作为固定剂)时，应注意其可能引起蛋白质共价交联，从而使膜蛋白丧失维持细胞内外离子浓度梯度的功能，不利于可扩散离子的分布研究。

组织、整体动物和固体制剂通常需要制成切片。切片前应根据样本性质选择是否需要包埋来维持样本在切片过程中的完整性。对于眼组织等脆弱的组织、整体动物等较大的样本以及不易完整切片的固体制剂常需要作包埋处理：组织样本可用纯水或明胶包埋；整体动物样本和固体制剂可用羧甲基纤维素包埋。切片通常采用冰冻切片机，温度控制在-16℃~-26 ℃；一般组织密度越大，切片温度越高。切片的厚薄也很重要：切片过薄，容易在转移过程中撕裂；切片过厚，则不利于清洗除去一些对离子信号有干扰的物质且导电性差。

样本转移至质谱靶主要通过融裱法和胶带法，分别是在室温下直接将冷冻组织切片粘到靶上，或用导电双面胶将样本固定在质谱靶上。固体制剂切片和整体动物切片通常使用胶带法转移。样本转移至质谱靶后，需立即对载有样本的质谱靶进行干燥处理以保持样本稳定。常用的干燥方法有冷冻干燥、真空干燥、溶剂脱水干燥和氮气吹干。

干燥后的样本一般可直接进行质谱分析，复杂样本中特定待测物的检测常需采用溶剂清洗、表面酶解和化学衍生化等对分析表面进行适当处理。

研究表明，用适当溶剂清洗载有样本的质谱靶，既能起到脱水固定作用，还能显著改善质谱测定结果。如蛋白组学分析时，常用70%～100%乙醇洗去抑制蛋白质离子化的小分子和脂质，以增强多肽、蛋白质的检测灵敏度；而分析小分子时，则应尽量避免有机溶剂清洗，除非已明确待测物在所用溶剂不溶或几乎不溶。分析脂质和小分子药物时，使用特定pH的缓冲液清洗组织切片，可以除去内源性盐类等抑制离子化的物质，以提高检测信号强度。甲酸铵溶液可用于细胞表面盐类的清洗，既维持细胞渗透压和酸碱平衡，又不影响细胞形态。

由于MSI常用的离子化方式对多肽的检测灵敏度显著高于对完整蛋白质的检测灵敏度，故蛋白质原位分析时，有采用胰蛋白酶先对样本表面的蛋白质进行原位酶解，产生相对分子质量范围在400～3500的多肽后再检测的报道。但因酶解过程中，待测物可能发生移位，内源性酶活性也可能恢复，因此原位酶解方式主要用于内源性蛋白质的鉴定，而非定量分布研究。

对于难电离的物质或者存在内源性背景干扰，在样品表面进行化学衍生化将有利于待测物的MSl分析。

质谱成像分类

这种方法可用于小分子代谢物，药物化合物，脂质和蛋白，而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体。下面列出五种先进的质谱成像方法。

MALDI质谱分子成像技术

MALDI 质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI 系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比（m/ z）信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/ z 的范围，即可确定该组织区域所含生物分子的种类，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。

电喷雾电离技术

一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此并不适用于即时成像（bedside applications），比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。

一种称为电喷雾电离技术（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。

这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源：SIMS（二次离子质谱）有些相似，只是前者能在大气压下游离化，发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒（比如水或者乙腈acetonitrile）进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。

APIR MALDI/LAESI技术

了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。

来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离（MALDI）质谱分析需要在真空中进行，但活体样本在真空中无法存活。

实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线（an atmospheric pressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。

为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。

与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。

3D成像——二次离子质谱技术

质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。

但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的Nicholas Winograd教授改进了一种称为二次离子质谱（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。

这种技术具有几个优点：速度快（－10,000 spectra per second），亚细胞构造分辨率（－100 nm），以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。

Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束（carbon-60 磁性球），这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”（molecular depth profiling）。

C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。

这里还要说到一点，SIMS和上一技术（APIR MALDI/LAESI技术）都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子（二级离子），离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。

纳米结构启动质谱技术

质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。

NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。

通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。

由于含氟聚合物不能很好的离子化，因此会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。

应用

脑肿瘤：2001年Stoeckli 等首次证实质谱成像技术在肿瘤研究中的巨大潜能，该文论述了如何应用质谱成像技术揭示胶质母细胞瘤组织切片的化学空间结构。该研究结果显示，蛋白胸腺素β4常出现在肿瘤团块增殖最活跃的部分，而蛋白S100A4则出现在肿瘤团块的中心。随后质谱成像技术被证实可直接进行组织分析定位神经胶质瘤，并进行神经胶质瘤的恶性程度分级。

肺癌：Groseclose 等应用质谱成像技术对包含 112 例针吸活检标本的小型肺癌组织芯片进行了研究。首先，由一位病理学家在光镜下对该组织芯片的HE染色切片进行分析划分每一例活检标本的癌区、癌旁区和正常组织区。随后，来自相同活检标本的未经病理标注组织芯片与病理标注组织芯片的HE染色切片进行匹配比对，划定未经病理标注组织芯片的癌区、非癌区范围，最后用未经标注的组织芯片进行组织溶解质谱成像。进行质谱成像的组织芯片上，一部分针吸活检组织作为训练组，并用病理学家的诊断对训练组针吸活检组织的质谱信号进行标注，建立分类模型。这个包含73个胰蛋白酶肽峰的基于支持矢量机的分类模型对腺癌的识别准确率为97.9%，对鳞癌的识别准确率为98.6%。

乳腺癌：雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2状态与乳腺癌的诊断及治疗密切相关。近年来，有研究表明，对上述3种蛋白mRNA的多重检测能大幅提升乳腺癌的诊断水平，并指导乳腺癌的个体化治疗。