原理

利用酶标记抗原(抗体)和待测抗体(抗原)在电场中向一定方向移动,在比例适当的地方形成沉淀线,通过酶作用底物而显色,指示沉淀线的存在。该法的敏感性大大高于对流免疫电泳。

本试验以检测血吸虫抗体为例。

材料试剂

1.0.02Mol/pH8.6巴比妥缓冲液

巴比妥0.553g

巴比妥钠3.503g

乳酸钙0.512g

H2O加至1000ml

2.0.1Mol/LpH7.0PBS(0.14Mol/LNacl)

3.0.2Mol/LpH7.6硼酸缓冲液

硼酸10.510g

硼砂2.860g

H2O加至1000ml

操作方法

酶免疫电泳

1.酶标抗原的制备用1ml血吸虫卵抗原(蛋白含量为1.5mg/ml~2.0mg/ml)加入3mg~4mg辣根过氧化物酶(蛋白质:酶=1︰2),液体呈棕红色,然后在轻轻搅拌下,缓慢加入50μl1%戊二醛,要求在5min~10min内滴加完毕。置20℃~25℃搅拌2h。装入透析袋,于1000ml、0.1Mol/LpH7.0PBS液4℃透析2天,并换液3次~4次。取出酶标记物加等量纯甘油,使含50%甘油试剂,即为酶标抗原。分装小瓶,存于-20℃中备用。

2.琼脂凝胶板的制备取优质琼脂,以0.02Mol/LpH8.6巴比妥缓冲液制成1%琼脂,溶化后,置于玻片上,制成2mm厚的凝胶板。

3.打孔加样打6对孔,抗原孔径为0.30cm,抗体孔为长方形0.2cmױ.1cm。抗原、抗体各加5μl及50μl。抗原用上述酶标抗原做1︰20至1︰30稀释。

4.电泳抗原孔置于负极,电压4V/cm~5V/cm,电泳时间45min~60min,电泳后,于蒸馏水中荡洗1min~2min即可,用滤纸吸去水分,并用毛细吸管吸尽长孔及圆孔中的水液后,即可用底物的溶液显色。

5.配制底物溶液,现用现配。将饱和联苯胺溶液,加等量pH7.6硼酸缓冲液,然后将上液9份和0.1%过氧化氢1份相混,即为所需的底物溶液。

6.免疫酶染色将琼脂凝胶板置于培养皿中,缓缓倾入底物溶液,直至浸没凝胶板为止,置于室温或37℃,经1h~2h用目测可观察反应结果。

结果判定

1.阳性反应:在抗原抗体孔之间呈现明显的棕红色的线条。

2.阴性反应:不出现棕红色线条者。

相关词条

抗原、沉淀线、血吸虫抗体、巴比妥、巴比妥钠