吸光光度分析（吸光光度分析）

定律简介

全自动生化分析仪检验血液中各物质含量的分析是吸光光度分析方法的应用之一，根据分析化学中的显色反应，利用不同的生化试剂把不同物质的含量通过颜色深浅反应出来，再由郎伯-比尔定律定量分析其浓度。

原理介绍

布格（Bouguer）和郎伯（Lambert）先后在1729年和1760年阐明辐射强度和吸收层厚度的关系，1852年比尔（Beer）又提出辐射强度和吸收物浓度也具有类似的关系，这便是著名的布格-郎伯-比尔定律。比尔定律的数学表达式为：

A= = bc (2-1)

式中，A为吸光度，I0为入射辐射强度，It为透过辐射强度，b为吸收层厚度（cm），C为吸收物的摩尔浓度（M），ε为摩尔吸光系数（L﹒mol﹒cm）。此定律广泛应用于紫外-可见-红外光谱区吸收测量，全自动生化分析仪中各项生化指标的检验也依据于此定律。

比尔定律的成立是以下列条件为前提的：

入射辐射为单色辐射；吸收过程中各物质无相互作用，但各物质的吸光度具有加合性；辐射与物质的作用仅限于吸收过程，没有荧光、散射和光化学现象；吸收物是一种均匀分布的连续体系。

如偏离以上任意一点，吸光度与浓度（或吸收层厚度）的线性关系将受影响，从而影响分析结果的准确度。其中（2）、（3）由生化分析试剂的特性来保证，（1）由光学系统来保证，（4）由搅拌机构来保证。

误差来源

荧光和光化学反应的影响

通常的生化试剂的荧光效率很低，产生的荧光又是各向同性的，只有非常少的一部分沿透射方向进入检测器，所以荧光的影响是可以忽略的。

采用后分光技术时，即复色光先照射比色池再进入单色器，由于样品所受的光辐射比较强，有可能发生光化学反应，因此，一方面要尽量减弱入射光的强度，另一方面要选择不容易发生光化学反应的检验试剂。

反射和散射效应的影响

比尔定律成立的前提条件是吸收物是一种均匀分布的连续体系，如果待测液体有浑浊质点，当光辐射通过时会产生散射效应，它对吸光光度分析方法测量的影响表现为光程不确定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致比尔定律的偏离。然而，浑浊的试样在临床生化检验中是极为常见的，甚至一些检验项目本身就是以测量试样浊度为基础的，为了减小散射效应的影响，可采取双波长或三波长分光光度法。

光的非单色性带来的误差

比尔定律的重要假设条件之一是入射光为单色光，但是，即使是现代高精度分光光度计，也不可能获得纯单色光。分光光度计单色光的纯度主要取决于色散元件和光学系统设计。大多数分光光度计只能获得近似于单色的狭窄通光带，它仍然具有复色光的性质，而复色光可导致比尔定律的正或负向偏离。

仪器的组成

光源（电源）系统：光辐射与I的4次方成正比

恒温系统：37

单色器：滤光片、光谱仪

比色池：流动、分立

探测器：光电池、光电倍增管

放大器：高输入阻抗、低噪声、电流-电压变换

数据采集：A/D精度要求，3ABS=1/1000；3ABS-2.999ABS=18位A/D；1ABS-0.999ABS=12位A/D

分析软件：医学相关