茚三酮反应（一种化学反应）

简介

茚三酮反应化学式

反应机理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生CO2、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。但也有些物质对茚三酮也呈类似的阳性反应，如β-丙氨酸、氨和许多一级胺化合物等。所以定性或定量测定中，应严防干扰物存在。

显色反应方法

显色方法有下列数种： 

常用法

将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。 

使各种氨基酸呈现不同颜色的方法

1. 用0.4g茚三酮，10g酚和90g正丁醇的混合液显色。
2. 用1g/L茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。
3. 用1g茚三酮，600mL无水乙醇，200mL冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80℃染色5～10min。 

使显色稳定的方法

1. 配制含醋酸镉2g加蒸馏水200mL及冰醋酸40mL的贮存液。将上述贮存液加200mL丙酮及2g茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点也比较稳定。
2. 用含2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。 

反应应用

茚三酮反应作为用来检测α-氨基酸与多肽常用手段。其应用举例如下：

茚三酮显色法测定壳聚糖含量

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基衍生物，是一种分子量较大的碱性多糖。由于分子间和分子内强烈的氢键作用，壳聚糖在水及大多数溶剂中的溶解性较差，可溶于醋酸等无机酸的稀溶液中。壳聚糖及其衍生物具有较强的生物活性，具有抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂和增强免疫力等功能。壳聚糖还具有良好的生物降解性和生物相容性，被广泛应用于生物医学、环境科学、食品等领域。随着壳聚糖产品的大量开发及上市，对其进行含量测定也逐渐受到了重视。 

有研究根据壳聚糖与茚三酮作用形成的复合物在570nm处有特征吸收的特性，建立了利用分光光度法测定壳聚糖含量的方法。该测定方法的适宜条件为：在pH5.5的HAc-NaAc缓冲体系中，当缓冲溶液用量为2.00mL、茚三酮(浓度为10.00g/L)用量为1.00mL、加热煮沸20min时，显色效果最好。 

在0.004～0.04g/L浓度范围内，壳聚糖浓度与其吸光度值线性关系良好，所得标准曲线方程为：y=23.942x+0.1423，相关系数r2=0.9981。稳定性、重现性和回收率实验结果表明，该显色方法在2h内稳定性良好，精密度可靠。 

实验中发现，壳聚糖与茚三酮作用显色后，除了在570nm处有显著的紫外吸收外，在408nm处也有一明显吸收，并且与壳聚糖的浓度具有较好的线性相关性。估计是由于显色过程中改变了壳聚糖结构所致，在今后的研究中可予以关注。实验结果表明，利用茚三酮显色法测定壳聚糖含量的实验方法操作简单，反应条件也比较容易控制，且重现性好，适用于样品中微量壳聚糖的检测。 

茚三酮法定性定量检测丝氨酸

随着人们对丝氨酸生理作用的深入认识和医药保健事业的不断发展，医药、食品、饲料等行业对丝氨酸的需求量正迅速扩大。虽然L-丝氨酸属于非必需氨基酸，但它却具有许多重要的生理功能及用途，在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。因此，测定混合氨基酸中丝氨酸的含量对丝氨酸的开发利用具有重要意义。α－氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色或蓝色物质 

脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。丝氨酸和茚三酮在弱酸性条件下共热可以生成紫红色的缩合物质，且其颜色随着丝氨酸的含量变化而有所不同为了快速简便地检测氨基酸水解液中丝氨酸的含量，有研究提出了一种基于氨基酸纸上层析的改进茚三酮显色法，并将其应用于难以分离的氨基酸的检测。首先，将茚三酮加入到展层剂中，再对氨基酸混合液进行层析。 

在一定条件下将层析后的茚三酮与氨基酸进行显色反应，根据不同颜色即可鉴别丝氨酸。然后，对不同剂量的丝氨酸标准液使用上述方法绘制丝氨酸标准液的吸光度－含量的标准曲线，用以计算氨基酸水解液丝氨酸的含量。结果表明：茚三酮法定性定量检测丝氨酸的最佳实验条件为溶液pH在4.5左右，显色剂用量为每10mL展层剂中加入2.5mL0.1%茚三酮，并在105℃下加热5min。 

茚三酮真空熏显手印

1910年，英国科学家鲁赫曼在实验时，无意中合成一种新的化合物-水合茚三酮。随后，鲁赫曼发现水合茚三酮能与氨基酸反应生成一种紫色产物，这种紫色后被称为鲁赫曼紫。1954年，两位瑞典科学家奥登和霍夫施坦首先提出用茚三酮显现潜在手印。至今，茚三酮一直是显现渗透客体检材上潜在指印的最常用、最有效的显现方法。 

茚三酮主要是通过与手印遗留物中的氨基酸发生反应，产生紫色的混合物达到显现潜在手印的目的。茚三酮在真空加热情况下可以升华，成茚三酮蒸汽。当茚三酮蒸汽遇到手印遗留物中的氨基酸时，茚三酮与氨基酸发生反应，变成紫色的混合物，从而显现潜手印。操作时，可以利用真空熏显柜，如没有真空熏显柜，也可以直接用酒精灯加热方法。 

操作方法如下：把样品固定在真空加热加湿熏显柜内，把锡箔碗放在加热器上，碗中均匀撒放0.1～0.5g茚三酮晶体。先把柜子抽到真空，再接通加热电源，当到达一定温度时，茚三酮晶体升华变成气体，与样品上手印遗留物中的氨基酸发生反应，显出指纹。 

由于真空加热加湿熏显仪能加热，使茚三酮晶体直接升华成气体，与手印中的氨基酸发生反应；真空条件则保证茚三酮晶体快速升华，变成气体，并能在柜内均匀扩散，有效与手印中的氨基酸发生反应，保证显现质量；加湿能够有效改善熏显效果，明显提高手印显现率。 

制备茚三酮/纳米二氧化钛复合物

制备方法包括：步骤1，配制前驱体溶液；步骤2，利用抽滤将前驱体溶液通过经脱水处理的滤膜，使滤膜饱和吸附前驱体溶液；步骤3，同样利用抽滤将茚三酮溶液通过滤膜，反应生成茚三酮/纳米二氧化钛复合物。所述复合物对氨基酸具有较好的显色灵敏度，可作为薄层层析板检测氨基酸的显色剂。将上述复合物掺入到薄层层析板的固定相中制得新型薄层层析板，利用该薄层层析板可实现层析分离与显色过程一步完成，使用便捷。 

影响因素分析

茚三酮与谷氨酸的显色反应灵敏度较高,但同时也受到多种因素的影响。

当实验条件控制不好时,会造成实验数据的较大偏离,从而产生较大的误差。此显色反应的影响因素主要有以下几方面。 

谷氨酸浓度的影响

实验表明,谷氨酸与茚三酮水溶液在表3所注条件下反应的最低显色浓度为70μg/mL。随谷氨酸浓度变大,显色逐渐变深。当浓度大于140μg/mL时,所显颜色过深且其光密度值超出量程。当谷氨酸浓度在80～140μg/mL时,颜色变化明显且显色较稳定。 

注:90℃下水浴25min,谷氨酸标准液5mL,茚三酮水溶液1mL,pH6.0。

pH值的影响

以100μg/mL的谷氨酸标准液在不同pH下进行显色反应,测得结果如表。 

注:90℃下水浴25min,谷氨酸标准液5mL,茚三酮水溶液1mL

由表2可见,显色反应随pH的不同颜色有明显的变化。当pH在4以下时不显色,而pH在6～10时,颜色变化明显。但因茚三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色,因此pH选定在6左右较好,此时基本无颜色干扰且显色稳定。 

温度及反应时间的影响

实验表明,温度和反应时间对此显色反应的影响也很大。以100μg/mL的谷氨酸标准液在70℃进行显色发应时,发现即使加热30min也基本无颜色变化。当温度为80℃时,加热30min以上有颜色变化,而当温度为90℃时,加热15min左右即有明显的颜色变化,沸水加热时颜色变化也很明显。但考虑到蒸发的影响,所以实验选用90℃作为最佳反应温度。在显色反应中,反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说,当谷氨酸浓度在80～140μg/mL时,90℃加热20min以上即可完全反应。时间太短,反应不完全,颜色梯度不明显,所以最佳反应时间在20～25min。 

注:谷氨酸标准液5mL,茚三酮水溶液1mL。

其它影响因素

茚三酮的不同溶剂对显色反应也有影响。实验表明,茚三酮的丙酮溶液在80℃以上时显色较好,而茚三酮的水溶液要在90℃以上时显色才明显。茚三酮的用量对显色反应的影响不大,可选择5mL(或3mL)被测液与1mL(或0.5mL)茚三酮溶液反应。测定时,最好选择谷氨酸标准样与待测稀释液一同水浴,这样可提高测定的准确度。此外,当被测样品中含有其它氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应,从而影响测定结果。但在谷氨酸发酵中,所产的谷氨酸含量一般是其它氨基酸的几十倍,故此影响因素可忽略不计。 

总之,茚三酮比色法作为一种谷氨酸的定量检测方法,具有操作简单、成本低的优点。只要控制好实验条件,就能取得较好的测量结果。这对于一般实验室的样品分析及味精生产厂家的谷氨酸产品测定,有较好的实用价值。