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激光扫描共聚焦显微镜
近代生物医学图象仪器
基本信息
| 中文名 | |
| 外文名 | Confocal laser scanning microscope |
| 别名 | CLSM |
| 电子产品类别 | 仪器 |
| 用途 | 近代生物医学图象仪器 |
| 优势 | 增强对比度、提高分辨率 |
| 领域 | 光学成像技术手段 |
| 开始发展时间 | 20世纪80年代中期 |
收起
发展沿革
激光扫描共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope）是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。
传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构，不仅图像与背景的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ为显微镜的分辨率；λ为照明光线的波长；NA为物镜的数值孔径)。但当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构(如耳蜗基底膜。其实是外毛细胞、多种支持细胞、神经纤维等组成的空间结构),，在普通光学显微镜下聚焦平面的变化，会表现出不同的形态。假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布，且重叠在一起，反射荧光显微镜(epifluorescentmicroscope)不仅从焦平面上收集光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收，荧光显微镜的光学分辨率就要大大降低。
在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如CapH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。
结构
激光扫描共聚焦显微镜
在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”（Opticalsectioning）、三维重建、动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。此外，CLSM对荧光样品的观察具有明显的优势，只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
原理
激光扫描共聚焦显微镜
功能特点
应用功能
激光扫描共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。
组织和细胞中的定量荧光测定
激光扫描共聚焦显微镜可以从固定和荧光染色的标本以单波长、双波长或多波长模式，对单标记或多标记的细胞及组织标本的共聚焦荧光进行数据采集和定量分析，同时还可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加，形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，以显示荧光在形态结构上的精确定位。常用于原位分子杂交、肿瘤细胞凋亡观察、单个活细胞水平的DNA损伤及修复等定量分析。
细胞间通讯的研究
动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通信在细胞增殖和分化中起着重要作用。激光扫描共聚焦显微镜可通过观察细胞缝隙连接分子的转移来测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质。该技术可以用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用，也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。
细胞物理化学测定
激光扫描共聚焦显微镜可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定。能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。
激光扫描共聚焦显微镜技术是测量若干种离子浓度并显示其分布的有效工具，对焦点信息的有效辨别使在亚细胞水平显示离子分布成为可能。利用荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可以测量单个细胞内pH和多种离子(Ca、K、Na、Mg)在活细胞内的浓度及变化。一般来说，电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快，但其图像本身的价值较低，而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。
三维图像的重建
传统的显微镜只能形成二维图像，激光扫描共聚焦显微镜通过对同一样品不同层面的实时扫描成像，进行图像叠加可构成样品的三维结构图像。它的优点是可以对样品的立体结构分析，能十分灵活、直观地进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。
荧光漂白恢复技术
该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力，而邻近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可逐渐恢复。可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。
长时程观察细胞迁移和生长
活细胞观察通常需要一定的加热装置及灌注室，以保持培养液的适宜温度及CO浓度的恒定。目前的激光扫描共聚焦显微镜，其光子产生效率已大大改善，与更亮的物镜和更小光毒性的染料结合后可以减小每次扫描时激光束对细胞的损伤，用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。
应用领域
在细胞及分子生物学基础研究中的应用
激光扫描共聚焦显微镜应用照明针与检测孔共轭成像，有效抑制了焦外模糊成像并可对标本各层分别成像，对活细胞行无损伤的“光学切片”这种功能也被形象的称为“显微CT”。CLSM还可以对贴壁的单个细胞或细胞群的胞内、胞外荧光作定位、定性、定量及实时分析，并对胞内成分如线粒体、内质网、高尔基体、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+等的分布、含量等进行测定及动态观察，使细胞结构和功能方面的研究达到分子水平。
在肿瘤和抗癌药物筛选研究中的应用
普通显微镜及电子显微镜，仅能对肿瘤相关抗原进行定性分析，而CLSM则可对单标记或者多标记细胞、组织标本及活细胞进行重复性极佳的荧光定量分析，从而对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征，抗肿瘤药物的作用及机制等方面定量化。
在血液病学和医学免疫学研究中的应用
在大脑和神经科学中的应用
激光扫描共聚焦显微镜分层扫描发现神经轴突的内部结构连续性好。用激光扫描共聚焦显微镜能观察到脑干组织中神经轴突的正常走向，可排除在荧光显微镜下由此造成的一些病理假象。并且激光扫描共聚焦显微镜能观察神经轴突的三维结构，因此应用CLSM有可能观察到普通光镜下未能发现的神经组织的细微病变。
在眼科研究中的应用
在骨科研究领域中的应用
激光扫描共聚焦显微镜在骨科研究领域的应用现状表明，CLSM在观测骨细胞形态学研究、骨细胞特异性蛋白（骨钙素）以及骨细胞之间的相互作用具有显著的优势。
结语
激光扫描共聚焦显微镜作为一项全新的实验手段和强有力的研究工具，为我们解决一些以往研究工作中不能解决的技术难题创造了条件，因而必将得到更为广泛的应用。随着新软件的不断开发及各个学科的不断发展和相互渗透，相信它还将会有更广阔的发展前景。
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