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乳酸脱氢酶
NAD依赖性激酶
基本信息
| 中文名 | 乳酸脱氢酶 |
| 别名 | LD或LDH |
| 外文名 | lactate dehydrogenase |
| 影响 | 可用于心肌疾病的诊断 |
| 所属学科 | 医学检验 |
| 性质 | 氧化还原酶 |
| 作用 | 糖酵解酶之一 |
| 亚基 | LDHA、LDHB、LDHC |
收起
测定方法
参考值
血清：35-88U/L（pH8.8-9.0 ，30°C）； 100-225U/L（pH8.8-9.0，37°C）。
尿：42-98U/L（pH8.8-9.0，25°C，连续监测LD-L法）。
血清：200-380U/L（连续监测LD-P法）。
血清：95-200U/L（pH7.4 ，30°C ；200-380U/L（pH7.4，37°C）。
脑脊液：7-30U/L（pH7.4，30°C ，比色法）。
注意事项
由于红细胞内LDH含量比正常血清中LDH活性高1000倍，溶血时血清LDH活性显著增高，故送检标本不能溶血。由于草酸盐抑制LDH，故测LDH活性，宜采用血清而不采用血浆。另外，若血清中未除尽血块，无论在4℃还是室温存放标本，LDH活性都将明显增高。
分类
根据结合辅酶的不同，微生物体一般包含两种乳酸脱氢酶，NAD-依赖型乳酸脱氢酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依赖型乳酸脱氢酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）两大类。NAD-非依赖型乳酸脱氢酶，也被称作呼吸链乳酸脱氢酶，在微生物体内通常被认为是负责乳酸氧化的酶类。它们编码的基因与乳酸利用相关的乳酸透性酶和调节蛋白编码的基因较近。相较于NAD-非依赖型乳酸脱氢酶，NAD-依赖型乳酸脱氢酶分布范围更广泛，在人体、动物以及微生物中都普遍存在。在微生物中，NAD-依赖型乳酸脱氢酶存在于其细胞质中，体外实验证实：NAD-依赖型乳酸脱氢酶能够以NADH为辅因子催化丙酮酸还原生成乳酸，并且氧化NADH为NAD，同时该酶在特定的条件下可以催化逆反应的进行，但是活力非常弱，不容易检测。一般说来，与NAD-依赖型乳酸脱氢酶以NADH为辅因子不同的是NAD-非依赖型乳酸脱氢酶主要利用黄素。NAD-依赖型乳酸脱氢酶也可以在体内催化乳酸的氧化，但体外实验可能需要较高的pH和底物浓度。
乳酸脱氢酶
按其催化底物的构型不同，NAD-依赖型乳酸脱氢酶可以分为NAD依赖型-L-乳酸脱氢酶（L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）和NAD依赖型-D-乳酸脱氢酶（D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）两大类，分别催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。研究表明，虽然L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶和D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶均催化丙酮酸合成乳酸，但二者的基因序列不具有相似性或一致性。已知的不同乳杆菌的D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶之间存在40%～50%的氨基酸同源性，而D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶和L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶之间则只存在10%左右的同源性，表明两种脱氢酶分别由两个完全不相关的家族进化而来。不仅如此，酶之间的差异也表现在动力学参数差异明显，比如，两者催化反应的反应常数kcat和米氏常数Km不同。
根据天然电子受体的不同，可以将NAD-非依赖型乳酸脱氢酶分为三类。第一类为膜蛋白，利用膜醌类作为外部的电子受体；第二类直接利用O2作为电子受体，根据氧化终产物的不同，又将其细分为乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸单氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者产生丙酮酸和H2O2，而后者产生乙酸、CO2和H2O；第三类是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的电子受体为细胞色素c。大多数L-NAD-非依赖型乳酸脱氢酶属于α-羟酸氧化黄素蛋白家族，利用还原型黄素单核苷酸（Flavin mononuleotide，FMN），而所有的D-NAD-非依赖型乳酸脱氢酶均可利用黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）作为电子受体，而不是FMN，它们具有FAD结合的氧化还原酶/转移酶4的家族特征。此外，D-NAD-非依赖型乳酸脱氢酶还可以利用醌类或细胞色素c作为电子受体，但是迄今为止，还没有D-NAD-非依赖型乳酸脱氢酶直接利用O2的相关报道。Wolin的研究表明，一些链球菌LDHs的催化活性绝对依赖于果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-Diphosphate，FDP）。其他链球菌、双歧杆菌属的所有种、干酪乳杆菌和木糖乳杆菌等都发现了相似的NAD-非依赖型乳酸脱氢酶。
结构功能
研究表明，L-乳酸脱氢酶（L-LDH）和L-苹果酸脱氢酶属于同一家族，而D-乳酸脱氢酶（D-LDH）属于D-2-羟酸脱氢酶家族。
D-乳酸脱氢酶
大多数D-乳酸脱氢酶催化是可逆反应，极少数不可逆；对于可逆的D-乳酸脱氢酶来说，只有环境中乳酸浓度较高时才催化逆反应，即催化乳酸合成丙酮酸，来参与细菌的代谢。
D-乳酸脱氢酶的一级结构比对表明，不同种属的D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列存在较大的差异，但是参与丙酮酸的结合与催化的氨基酸残基却十分保守。Kochhar等的研究显示L.bulgaricus的D-乳酸脱氢酶是一个由相同亚基组成的二聚体，每个亚基由332个氨基酸残基组成，分子量为36.8 ku，经化学修饰发现位于催化中心的三个组氨酸（His205、His296和His303）和Asp259对底物的催化具有十分重要的作用。Kochhar等还发现，His289也参与了底物结合，但His289不是D-2-羟基酸脱氢酶家族中保守的氨基酸残基。另外，通过对Cys残基的化学修饰发现Cys234可能参与底物结合和催化作用，这在L.helveticus的羟基丙酮酸还原酶中也能得以证实。研究还发现L.helveticus CNRZ32 的D-乳酸脱氢酶氨基酸序列和D-2-羟基酸脱氢酶家族的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、羟基丙酮酸还原酶和D-2-羟基己酸脱氢酶存在很高的同源性，这也暗示了该酶是D-2-羟基酸脱氢酶家族的一个成员。Razeto等对L.bulgaricus的D-乳酸脱氢酶构象进行了研究，结果发现L. bulgaricus的D-乳酸脱氢酶是一个由两个相同的亚基构成的不对称酶，A亚基的酶蛋白是典型的“开放”构象，而B亚基是典型的“闭合”构象。其中NADH的结合位点主要存在于B亚基中，而在A亚基中仅有30%，同时在底物结合口袋中有一个硫酸根离子。另外，该研究还建立了丙酮酸分子在活性位点的模型。在闭合域中，存在一簇疏水的氨基酸残基紧紧围绕着丙酮酸分子的甲基，在这个疏水氨基酸簇中至少有三个氨基酸残基（Tyr52、Phe299和Trp135’）决定底物的专一性。研究表明该底物结合位点有利于闭合域的稳定和酶的激活。
L-乳酸脱氢酶
大多数乳酸菌中不仅存在D-乳酸脱氢酶也存在L-乳酸脱氢酶，L-乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原生成L-乳酸。L-乳酸脱氢酶分为两型：一类可被FDP激活，属于别构酶；另一类不需要FDP激活，不具有别构效应。据Hiroyuki Uchikoba报道，L.pentosus的L-乳酸脱氢酶是一个非异构酶，但是它的氨基酸序列和一些细菌的别构LDH具有很高的相似性。该酶的四聚体由相同亚基组成对称的酶结构。它的活性构象和别构LDH的构象相似。
Kazuhito Arai等的研究表明，Lactobacillus的L-乳酸脱氢酶氨基酸序列中，Glu102、Asp197和Thr246是高度保守的，它们参与了底物的识别；另外，98-110氨基酸残基构成了活性位点环，它们参与催化反应。Arg171的胍基和丙酮酸的羰基形成双氢键，从而使丙酮酸在催化位点中处于正确的结合方向。研究表明，在L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列中同样存在一个与辅酶NADH结合的结构域Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-（17Xaa）-Asp，其中该结构域中的Asp决定了L-乳酸脱氢酶的辅酶是NADH，而不是NADPH4]。L.pentosus中L-乳酸脱氢酶的活性位点和其他LDH相似，包括了参与催化与底物结合的保守氨基酸残基，如Aspl68、Argl71和Hisl955。其中，Argl71在底物的结合中起着重要作用；另外，Hisl95主要在催化过程中作为质子供体和受体。值得注意的是，虽然Bacillus 和Lactobacillus的L-乳酸脱氢酶在进化关系上存在很近的亲缘关系，但是活性位点环的氨基酸残基也存在差异，如101位Bacillus是Asn，而Lactobacillus是Pro。这表明L-乳酸脱氢酶是否来自好氧或厌氧的革兰氏阳性菌可以由这个位置的氨基酸残基是Asn101还是Pro101来识别。
生理生化
半寿期：10-160h。
稳定性：与温度有很大关系，不管在什么温度下保存均可导致酶失活。
分离纯化
主要作用
同工酶
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一类NAD依赖性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三种亚基，可构成6种四聚体同工酶。动物乳酸脱氢酶是由4个亚单位组成的四聚体，是一个具有5种同工酶形态的分子，即常见的A、B两种亚基构成的5种LDH同工酶（LDH1～5）。C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4。用电泳的方法可以将人和动物组织的LDH分离出5种LDH同工酶。
人血清中含有5种同工酶，按其组织来源来说，LD1和LD2主要来源于心肌，临床常用的α-羧基丁酸脱氢酶（α-HBD）实际上就是LD1和LD2的活性之和；LD3主要来源于肺、脾；LD4和LD5（特别是LD5）主要来源于肝和骨骼肌。正常人血清中LD同工酶活性大小顺序为：LD2>LD，>LD4>LD3，不少疾患不仅有LD总活性变化，而且由于病变的脏器不同，各个同工酶变化也不一致。
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